HPLC
Adrianna |
(high performance liquid chromatography) - wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa.
Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (wysokosprawna, wysokorozdzielcza) znalazła szerokie zastosowanie między innymi w analizie związków wielkocząsteczkowych, takich jak białka, sterydy, oligosacharydy, a także w analizie związków wysokowrzących i termolabilnych takich jak nukleotydy, glikozydy, węglowodory.
Jest to metoda szeroko stosowana w analizie zarówno chemicznej, farmaceutycznej, oraz toksykologicznej.
Zestaw do HPLC składa się z następujących elementów:
1. Zbiornik fazy ruchomej
2. Pompa
3. Miernik ciśnienia
4. Miernik przepływu
5. Dozownik – zawór sześciodrożny
6. Kolumna
7. Detektor
8. Zbiornik zużytej fazy ruchomej
9. Komputer
10. Rejestrator
Ogólna zasada działania przedstawia się następująco:
1.Pompa zasysa fazę ruchomą, za pomocą umieszczonego w zbiorniku fazy ruchomej przewodu. Na końcu przewodu znajduje się filtr, którego zadaniem jest zatrzymanie zanieczyszczeń stałych.
Zasadniczo stosowane są dwa rodzaje pomp:
- stałoprzepływowe
- stałociśnieniowe
Każda pompa zaopatrzona jest w miernik ciśnienia i regulator przepływu fazy ruchomej.
2.Miejscem w którym próbka zostaje wprowadzona do układu HPLC jest dozownik.
Głównie stosuje się dozowniki z zaworem sześciodrożnym.
3. Próba wprowadzana jest na kolumnę chromatograficzną. Uniwersalnym wypełnieniem kolumny jest krzemionka, która tworzy złoże czynne. Na kolumnie następuje rozdział mieszaniny. Dla prawidłowego rozdziału ważnym czynnikiem jest wysokość złoża. Faza ruchoma przepływa przez złoże pod ciśnieniem. Ciśnienie jest proporcjonalne do wysokości złoża i do wymuszonej szybkości przepływu.
4. Składniki rozdzielone na kolumnie trafiają do detektora. Pojawienie się w fazie ruchomej jakiegoś składnika z rozdzielonej mieszaniny powoduje zmianę transmisji światła (zwiększenie lub zmniejszenie absorpcji). Jest to rejestrowane przez fotoelement detektora i zapisywane przez rejestrator w postaci piku chromatograficznego.
Oznaczenie jakościowe przeprowadza się poprzez porównanie czasu retencji wzorca i próby badanej. Analiza jakościowa oparta jest na proporcjonalności między wielkością zarejestrowanych sygnałów (powierzchnia pod pikiem) dla substancji badanej i wzorcowej.