Izolacja DNA plazmidowego metodą lizy alkalicznej
Filip Gołębiowski | 2004-04-03
Metoda lizy alkalicznej służy do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych. Metoda pozwala na otrzymanie dobrze oczyszczonego materiału. W pierwszej kolejności zachodzi liza komórek bakteryjnych, denaturacja białek, oraz DNA. W drugim etapie "pokomórkowy gruz" jest strącany, a w roztworze pozostają cząsteczki plazmidów. Metoda, podczas oddzielania DNA plazmidowego, wykorzystuje różnicę w zdolności do renaturacji plazmidów i chromosomu bakteryjnego. To pierwsze ulega szybkiej renaturacji po usunięciu czynnika denaturującego (w tym wypadku zneutralizowaniu alkalicznego pH) i jest to trzeci etap procedury. Otrzymany plazmid może być oczyszczany na przystosowanych do tego minikolumnach, lub precypitowany w alkoholu w celu przechowania.
Metoda jest szybka i prosta w wykonaniu, przez co stała się popularnym sposobem uzyskiwania oczyszczonego plazmidu z komórek bakteryjnych.
Etapy procesu:
1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają lizozym, trawiący ściany bakteryjne;
2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek.
3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego.
Ad. 1
Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo można stosować lizozym.
Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa efekty:
– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;
– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły by pociąć plazmidowe DNA;
Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe dla protoplastów;
Ad. 2
W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS. W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod wpływem zasadowego pH.
Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.
Ad. 3
Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon, wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.
Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu. Poniższy protokół uwzględnia ten proces.
Przykładowy protokół izolacji plazmidów metodą lizy alkalicznej:
1. Hoduj kolonię przez noc w pożywce LB.
2. Weź 1,5 ml komórek, umieść w probówce i zwiruj, przy najwyższych obrotach tak, by bakterie zostały osadzone na dnie.
3. Usuń supernatant.
4. Bakterie zawarte w osadzie rozpuść w 100 μl roztworu GTE i przetrzymaj pięć minut w pokojowej temperaturze.
5. Dodaj 200 μl roztworu NaOH/SDS, wymieszaj przez potrząsanie probówką i umieść na lodzie przez 5 minut.
6. Dodaj 150 μl roztworu octanu potasu, wymieszaj i umieść w pojemniku z lodem.
7. Po kilku minutach zwiruj przez 3 minuty i przenieś supernatant do nowej probówki.
8. Do zawartości nowej probówki dodaj 0,8 ml 95% roztworu etanolu i przetrzymaj 2 minuty w pokojowej temperaturze.
9. Zwiruj zawartość probówki przez 1 minutę na najwyższych obrotach i usuń supernatant.
10. Dodaj 1 ml 70% roztworu etanolu, w celu przemycia osadu. Następnie usuń etanol, delikatnie by nie naruszyć osadu. Osusz osad dokładnie na powietrzu.
11. Rozpuść osad w 30 μl buforu TE. Tak przygotowane DNA plazmidowe może być przetrzymywane krótkoterminowo w temperaturze - 4˚C, lub długoterminowo w temperaturze -20˚C / -70˚C.
Materiały:
Bufor TE:
Nazwa pochodzi od pierwszych liter związków składowych buforu: Tris i EDTA.
Roztwór buforowy o pH 7,4; 7,5; 8,0 zawierający 10 mM Tris·HCl i 1 mM EDTA.
Roztwór GTE:
50 mM glukozy
25 mM Tris·Cl, pH 8,0
10 mM EDTA
Roztwór NaOH/SDS:
0,2 M NaOH
1% (w/w) SDS
Roztwór octanu potasu – bufor octanowy:
Jest to roztwór buforowy przygotowywany z lodowego kwasu octowego i zasady potasowej do uzyskania pH 4,8.
Wzory wybranych związków:
1. Tris: tris(hydroksymetylo)aminometan
2. Dodecylosiarczan sodu (SDS)
Wszelkie uwagi i pytania dotyczące tekstu wysyłajcie na mój adres e-mail: filip.golebiowski(a)gmail.com
Będę wdzięczny za każde Wasze opinie.