Real-Time PCR
Adrianna |
(PCR w czasie rzeczywistym) – metoda ilościowego oznaczania DNA. System ten pozwala na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ta reakcja właśnie przebiega.
Monitorowanie zmian w stężeniu produktu następuje poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do ilości produktu w mieszaninie.
Specyficzność reakcji real-time PCR zależy zarówno od chemicznej reakcji powielania, jak i od instrumentu stosowanego do monitorowania sygnału fluorescencyjnego.
W metodzie tej do uzyskania sygnału fluorescencji wykorzystywane są różne interkalujące barwniki (bromek etydyny, SYBR Green I) i hybrydyzujące sondy (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions).
Przebieg reakcji wykorzystującej barwnik SYBR Green I:
Barwnik SYBR Green I łączy się z dsDNA (nie wiąże się z ssDNA). W wyniku połączenia wzrasta fluorescencja (emisja ok. 560 nm). Fluorescencja zachodzi tylko wówczas, gdy SYBR Green I jest połączony z dsDNA, w innym przypadku fluorescencja nie zachodzi.
Wzrastająca ilość nowo syntetyzowanych nici, powoduje wzrost sygnału fluorescencyjnego.
Ograniczeniem tej metody jest to, iż SYBR Green I rozpoznaje sekwencje niespecyficzne. W rzeczywistości przyłącza się do każdej dwuniciowej cząsteczki DNA, łącznie z niespecyficznymi produktami reakcji PCR i dimerami utworzonymi przez startery. W celu ograniczenia tego mankamentu, przeprowadza się analizę krzywej topnienia, która pozwala wyeliminować komponenty niespecyficzne.
Specyficzność fluorescencji można zwiększyć przez zastosowanie sekwencyjnie specyficznych sond wyznakowanych fluorescencyjnie umiejscowionych pomiędzy parą starterów PCR.
Molecular Beacons są sondami DNA o strukturze typu szpilki do włosów. Sekwencja pętli jest komplementarna do specyficznej matrycy, sekwencje pnia są komplementarne do siebie. Końce 5’ i 3’ sondy są związane jedna z fluoroforem, a druga z wygaszaczem fluorescencji. W przypadku, gdy struktura szpilki jest zamknięta wygaszasz i fluorofor znajdują się blisko siebie wygaszasz absorbuje wszelkie emitowane przez fluorofor fotony (brak fluorescencji). W obecności komplementarnej matrycy, sonda rozwija się i hybrydyzuje. Fluorofor zostaje oddzielony od wygaszacza i sonda zaczyna fluoryzować.
Rys. Zasada działania sondy typu Molecular Beacons.