Sztuczna ewolucja białek
Kasia Kuleszewicz | 2007-06-11
Głównym problemem inżynierii białek jest zapewnienie cząsteczkom stabilności, dlatego też naukowcy próbowali zbadać które pozycje aminokwasowe warunkują stabilność cząsteczki białka. Naukowcy postanowili stworzyć cząsteczkę białka "od początku" i przy użyciu techniki zwanej sztuczną ewolucją określić jakie pozycje aminokwasowe białka są kluczowe dla danych właściwości fizycznych.
Białka zbudowane są z aminokwasów, których kolejność w łańcuchu polipeptydowym determinuje kształt i funkcję cząsteczki. Nadal jednak, nie jest zrozumiałym jak informacja o tak skomplikowanej trójwymiarowej strukturze określona jest przez jednowymiarową sekwencję aminokwasową.
W badaniu procesu składania białek używano dotychczas głownie metod polegających na substytucji aminokwasów. Miało to na celu określenie tolerancji poszczególnych pozycji w łańcuchu aminokwasowym na zmianę. Używano do tego celu dwóch metod. Jedna z nich polegała na filogenetycznym porównywaniu sekwencji aminokwasowych białek pochodzących od spokrewnionych organizmów. W ten sposób odkryto naturalne na przykład "warianty" hemoglobiny, które tolerują substytucje w zewnętrznych pozycjach bardziej niż w rdzeniowych – wewnętrznych. Metoda ta jest skuteczna przy profilowaniu pozycji aminokwasów podczas selekcji naturalnej odbywającej się podczas ewolucji.
Druga metoda jest metodą łączoną i wykorzystuje tzw. kasety do mutagenezy. Do danej sekwencji DNA wprowadzane są systematycznie mutacje zmieniające kodony DNA. Informacje uzyskiwane z poszczególnych mutacji powodujących w niektórych przypadkach substytucje aminokwasowe pozwalają określić pozycje kluczowe dla procesów takich jak np. składanie białka. Zestawy różnych wariantów białek podlegają następnie selekcji i analizie.
Wyniki dotychczas przeprowadzonych badań określiły, że rdzeniowe pozycji są wysoce zakonserwowane i substytucje tolerowane są w tym obszarze tylko wtedy, gdy fragment ten zachowuje naturę hydrofobową. Powierzchniowe pozycje aminokwasów, występujące w zewnętrznych regionach sekwencji peptydowych tolerują natomiast szeroką gamę substytucji. Te i podobne badania doprowadziły do wniosków, że aminokwasy zajmujące niedostępne pozycje w rdzeniu hydrofobowym zawierają większość informacji określających trójwymiarową strukturę, podczas gdy zewnętrzne zawierają informacje o aminokwasach stabilizujących proces składania białka.
Naukowcy z Biodesign Institute na Arizona State University postanowili naśladować proces darwinowskiej ewolucji w warunkach stworzonych w laboratorium. Wyniki badań zostały opublikowany 23 maja w magazynie PLoS ONE.
Za cel postawili sobie stworzenie białka "od początku", o właściwościach, które mogą mieć zastosowanie w biotechnologii. Przy użyciu narzędzi biologii molekularnej naukowcy próbowali wprowadzić takie zmiany w cząsteczkach białek, jakie w naturze zajęły 3 miliardy lat. Rodzicielska cząsteczka została stworzona już w 2001 roku i składała się tylko z 80 aminokwasów. Skutki wprowadzanych zmian były analizowane.
Teoria o konserwacji rdzeniowej sekwencji białka i mniejszej konserwacji zewnętrznych aminokwasów została podważona, ponieważ wyniki badań naukowców wskazują na to, że obie pozycje odgrywają istotną rolę w składaniu i utrzymaniu stabilności białek. Wiadomym jest, że stabilność białka związana jest z jego zdolnością do wiązania cząsteczek ATP.
Grupa naukowców stworzyła białko korzystając z już wcześniej opracowanego modelu i wprowadzając zmiany w sekwencji genu, "symulowali" oni ewolucję w wyniku, której stabilność białka miała ulec poprawie. Powstałe podczas "sztucznej ewolucji" białka poddano selekcji (wzorowanej na selekcji naturalnej) i wyodrębniono białka o najwyższej zdolności wiązania. Porównano następnie 80 aminokwasową sekwencję do sekwencji innych białek i pozwoliło to na identyfikację kluczowych dla stabilności aminokwasów i ich pozycji.
Okazało się, że za większą stabilność białka odpowiadały dwie substytucje: N32D i D65V. W pierwszej asparagina występująca na 32 pozycji została zastąpiona kwasem asparaginowym, w drugiej natomiast kwas asparaginowy na pozycji 65 został zastąpiony waliną.
Naukowcy przeprowadzili swoje badania przy użyciu metody podobnej do sztucznej ewolucji (ang. directed evolution). Metoda ta, obok remodelowania trójmywmiarowej struktury białka za pomocą programów komputerowych (Computer-aided remodeling design), umożliwia wprowadzenie zmian do sekwencji aminokwasowej białka. Sztuczna ewolucja, w odróżnieniu od komputerowego remodelowania nie wymaga znajomości sekwencji aminokwasowej białka. Polega ona natomiast na przypadkowym wprowadzaniu mutacji do sekwencji genu kodującego interesujące nas białko. Tworzone są miliony kopii takiego genu, które następnie podlegają selekcji. Mutacje mogą być prowadzone za pomocą technik takich jak: PCR podatna na błędy (error-prone PCR), tasowania DNA (DNA shuffling), czy za pomocą mutagenezy wykorzystującej noszące mutacje oligonukleotydy (oligonucleotide – directed mutagenesis). Stworzone biblioteki DNA wprowadzane są do bakteryjnych gospodarzy, gdzie każda bakteria dostaje jedną wersję genu. Geny są ekspresjonowane w bakteriach, a powstałe w ten sposób warianty białek selekcjonowane i analizowane.
Zrozumienie oddziaływań wpływających na składanie białek pomoże stworzyć białka o potencjalnie użytecznych dla biotechnologii właściwościach.
Źródła:
- ScienceDaily: "Scientists Evolve New Proteins From Scratch", May 23, 2007,
- Wikipedia: protein engineering
Komentarze
karol | 2007-06-14 00:00:00
bardzo ciekawy artykuł.
pozdrawiam