*Ulepszony* AAV dla terapii genowej
Kasia Kuleszewicz | 2006-02-19
Wirus towarzyszący adenowirusom (adeno-associated virus AAV) jest znanym, nieszkodliwy wirusem, występującym w ludzkim organizmie. Zainteresowanie nim wzrosło w ostatnich latach z uwagi na możliwość wykorzystania go w terapii genowej do przenoszenia obcych genów. Pomimo tego, że około 90% ludzi jest jego nosicielami, ich system immunologiczny reaguje nadal wytwarzaniem przeciwciał, które mają go zablokować i zneutralizować, gdy zostanie wprowadzony do organizmu. Powoduje to znacznie utrudnienia w przeprowadzeniu udanej terapii genowej.
Ludzie i wirusy ewoluowali razem przez miliony lat, a także walczyli o różne umiejętności. Jednak to wirusy opanowały te umiejętności, które pozwalają im powodować choroby u ludzi a nawet ich zabijać. Naukowcy z Uniwersytetu w Kalifornii, udowodnili, że wirusy, w tym przypadku łagodne (takie jak AAV), zmuszone do ewoluowania, mogą służyć człowiekowi.
Z tego powodu, naukowcy postanowili przyspieszyć proces ewolucji wirusa przez wprowadzenie bezpośrednich zmian w sposobie poruszania się. Pozwoliłoby to wirusowi niepostrzeżenie wnikać do organizmu, nie powodując reakcji ze strony układu odpornościowego, i tym samym wirus byłby bardziej realnym nośnikiem genu w terapii genowej. W dwóch pokoleniach wprowadzania zmian, po dwóch miesiącach w laboratorium, naukowcy odnieśli sukces i opublikowali swoje wyniki w magazynie Nature Biotechnology.
Bezpośrednia ewolucja została przeprowadzona głównie w celu zmiany aktywności enzymów.
Technika mogłaby być użyta w polepszeniu wielu cech wirusa AAV, aby stał się on bardziej wydajnym nośnikiem genów w terapii genowej.
Wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) zawiera jednoniciowy DNA obejmujący 4679 pz i jest zamknięty w zbudowanym z białek kapsydzie. To właśnie białkowy kapsyd jest rozpoznawany przez przeciwciała i w rezultacie tego, jest celem bezpośredniej ewolucji.
Aby zapewnić „surowy” materiał dla ewolucji – genetyczną wariację z której w procesie naturalnej selekcji wybrany zostanie najlepiej zaadaptowany organizm – naukowcy stworzyli zmutowanego wirusa. Wprowadzono w jego genach małe zmiany - przez podatną na błędy reakcję PCR i technikę rekombinacji. Po złożeniu cząstek wirusa wewnątrz kapsydu, wprowadzono je do surowicy krwi pobranej od królików immunizowanych przeciwko AAV (zawierających zatem wiele typów przeciwciał skierowanych przeciwko AAV). Jak się okazało, tylko zmutowane wirusy unikały przeciwciał skierowanych przeciwko AAV i przeżywały w surowicy.
Po trzykrotnym pasażowaniu wirusów, wyizolowano te które przetrwały w surowicy i poddano je kolejnej rundzie PCR, która wprowadziła kolejne mutacje. Po pasażowaniu drugiej generacji wirusów przez surowicę, wyizolowano wirusy, które mogły przetrwać działanie przeciwciał przeciwko AAV znacznie lepiej niż wyjściowy szczep AAV. Jeden szczep wirusa był 96 razy bardziej wytrzymały niż dzika wersja AAV, a dwa szczepy wirusa przetrwały w środowisku, gdzie była 1000-krotnie większa ilość przeciwciał niż ta, która niszczy dziki typ wirusa.
Po zsekwencjonowaniu najbardziej wytrzymałego szczepu wirusa, naukowcy odkryli, że białka otoczki wirusa różnią się od dzikiego szczepu tylko siedmioma aminokwasami, z których dwa były głównie odpowiedzialne za wytrzymałą interakcję z przeciwciałami. Naukowcy twierdzą, że bez użycia techniki bezpośredniej ewolucji nie udałoby im się określić, które to aminokwasy mają największe znaczenie w trwałości tego wirusa.
Źródło: UC Berkeley
Komentarze
Krzysiu | 2008-01-20 00:00:00
No tak, tylko pytanie, czy to bezpieczne? bo takie kombinacje mogą nie mieć dobrych skutków. myślę że najpierw zapanujmy nad wszystkimi wirusami, a potem dopiero je wykorzystujmy. Bo jak się wymkną z pod kontroli i to z naszą pomocą to będzie źle.