Wirusowe białka fuzyjne - Proponowany mechanizm fuzji przebiegającej w skutek obniżenia pH
Barbara Lachowicz | 2008-01-28
Fuzją określa się proces łączenia dwóch makrostruktur. Mogą nimi być przedsiębiorstwa energetyczne lub banki, ale znacznie bardziej spektakularnym procesem jest fuzja dwu błon biologicznych. W wysoce wyspecjalizowanej komórce eukariotycznej zachodzi ona niemal bezustannie i są to procesy niezbędne do prawidłowego funkcjonowania zarówno niej samej, jaki i całego organizmu. Egzocytoza hormonów, substancji przekaźnikowych, enzymów, a także powiększanie rozmiarów samej komórki i właściwa architektura plazmalemmy nie miałyby miejsca, gdyby nie integracja wytworzonych w głębi cytosolu pęcherzyków z błoną cytoplazmatyczną.
Fuzja to również zjawisko, któremu podlegać mogą całe komórki, czego znamiennym przykładem jest proces zapłodnienia, w trakcie którego błony komórki jajowej i plemnika zlewają się ze sobą, umożliwiając połączenie cennych zawartości obu gamet.
Jako zjawisko tak bardzo niezbędne, a jednocześnie niosące tak szerokie konsekwencje, fuzja dwu błon musi podlegać ścisłej kontroli. W przeciwnym wypadku mielibyśmy do czynienia z niekontrolowanym zlewaniem się sąsiadujących struktur supramolekularnych, organelli, a wreszcie i samych komórek. Najlepszym wyznacznikiem czasu oraz miejsca okazały się wyspecjalizowane białka. Zmniejszają one barierę energetyczną samego procesu, a także umożliwiają wzajemne rozpoznanie błon. Jednakże ewolucji podlegają wszystkie uorganizowane struktury. Wirusy, jako takie, również nie pozostały obojętne na upływ czasu i zmiany, które dokonywały się wokół nich. Wypracowały system pozwalający na połączenie, a dalej fuzję swojej otoczki z błoną zewnętrzną infekowanej komórki, zapewniając sobie w ten sposób efektywną taktykę wprowadzania własnego materiału genetycznego do komórki gospodarza.
Zaznaczyć należy, że w zależności od cyklu rozwojowego wirusa, fuzja taka może przebiegać na etapie kontaktu otoczki z plazmalemmą, jak i po endocytozie poprzez receptor, już wewnątrz komórki. Bez względu jednak kiedy, udział biorą w niej zawsze tzw. fuzyjne białka wirusowe. Podstawą ich mechanizmu działania jest jednoczesna interakcja z błoną wirusa (w której są zakotwiczone) i z błoną docelową.
W oparciu o podstawowe różnice strukturalne w grupie wirusowych białek fuzyjnych wydzielono dwie klasy, nazwane klasą I i klasą II. Do pierwszej z nich zalicza się białka rodzin Coronaviridae, Filoviridae, Arenaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae i Retroviridae. Do rodzin tych należą m.in.: wirus HIV, różyczki, Ebola, świnki, paramyksowirusy, a także wirus grypy, którego hemaglutynina (HA) jest jak dotąd najlepiej poznanym wirusowym białkiem fuzyjnym. Klasę drugą tworzą białka fuzyjne wirusów z rodzin Togaviridae i Flaviviridae, do której klasyfikuje się m.in. wirusa odkleszczowego zapalenia opon mózgowych, wirusa gorączki tropikalnej, żółtej febry i wirusa SFV (Semliki Forest Virus). Białka w obrębie klasy cechuje homologia strukturalna, tak pod względem budowy drugo- jak i trzeciorzędowej, natomiast różnice między klasami są istotne.
Cząsteczki białek klasy II mają cylindryczny kształt i są wydłużone. Zawierają zawsze trzy domeny, budowane przez struktury typu β-nici. Istotny dla mechanizmu reakcji peptyd (tzw. pętla fuzyjna) znajduje się w hydrofobowym wnętrzu białka. Cząsteczki ulokowane są równolegle do błony otoczki wirusa, natomiast po aktywacji ulegają reorientacji i strukturalnej reorganizacji. Jednakże pomimo znacznych homologii w zakresie budowy przestrzennej, białka te u różnych wirusów procesowane są w odmienny sposób. I tak, w przypadku flaviwirus (białko E) i alfawirus (białko E1) formowanie dimeru, inicjującego dalsze zdarzenia, następuje tylko w obecności różnego dla obu wirusów białka pomocniczego (także będącego składnikiem otoczki wirusowej). Różna jest także architektura samych dimerów, gdyż w przypadku flaviwirus formowane są jako homodimery, a dla alfawirusów jako heterodimery. Kolejne wydarzenia są już takie same dla wszystkich białek klasy II i obejmują rozcięcie białka czaperonowego przez egzogenną furynę, a następie indukowany pewnym bodźcem (np. związaniem receptora, ekspozycją na niskie pH endosomu, lub kombinacją obu tych czynników) rozpad dimeru i formację homotrimeru.
Po rozpadzie dimeru, znajdująca się na szczycie domeny II pętla fuzyjna zostaje odsłonięta i inkorporuje się do błony gospodarza, powodując tym nieodwracalną trimeryzację domeny II. Formacja trimeru pozwala na połączenie się pętli fuzyjnych, co kotwiczy stabilnie całą cząsteczkę w błonie gospodarza. Ponadto penetrująca swym transmembranowym fragmentem otoczkę wirusa domena III znajduje teraz stabilne połączenie z domenami I i II. Jej reorientacja (ang. refolding) powoduje silne zbliżenie obu błon i prowadzi do ich zlania się ze sobą. W efekcie, po zakończeniu procesu, zarówno śródbłonowy odcinek domeny III, jak i pętle fuzyjne znajdują się już w tej samej dwuwarstwie.
Ryc.1. Schematyczna wizualizacja fuzji otoczki wirusowej z błoną komórkową infekowanej komórki z udziałem białka klasy II. Tutaj na przykładzie glikoproteiny E flawiwirusa. [Sollner, 2004]
Prace dotyczące tematyki przyjęły określoną terminologię w opisie poszczególnych stanów, w jakich znajduje się cząsteczka białka fuzyjnego podczas infekcji wirusa. I tak, przed rozpoczęciem procesu białko przyjmuje konformację metastabilną, określaną jako konformacja „przedfuzyjna” (ang. prefusion), a zmiany, jakim podlega po wystąpieniu specyficznego bodźca prowadzą do uzyskania konformacji pofuzyjnej (ang. postfusion), która jest znacznie bardziej stabilna i która de facto umożliwia fuzję obu błon.
Białka klasy I, w odróżnieniu od omówionych powyżej, zlokalizowane są w błonie wertykalnie, a ich podstawowym motywem strukturalnym jest α-helisa. Ich struktura zostanie opisana w oparciu o przykład białka Parainfluenza virus.
Białko to ma charakterystyczny, grzybkowaty kształt. Jego „trzpień” tworzy pęczek helis (coiled-coil), budowany przez odcinek HRB (Heptad Repeat Region B). Natomiast „kapelusz” tworzy domena III, w obrębie której znajdują się odcinek HRA (Heptad Repeat Region A) i stosunkowo odsłonięty peptyd fuzyjny. Obecność domen I i II charakteryzuje wyłącznie rodzinę paramyksowirusów. W cząsteczkach białek innych rodzin zastępuje je krótki odcinek linkerowy, łączący HRA i HRB. Badania krystalograficzne cząsteczek pochodzących z otoczki wirusa NDV i wirusa hPIV (human parainfluenza virus) ujawniły istotne różnice konformacyjne stanów przed- i pofuzyjnego. Okazało się, że zupełnej zmianie ulega konformacja domeny III, a zwłaszcza regionu HRA, co skutkuje utworzeniem drugiej struktury coiled-coil. Umożliwia to jednocześnie insercję peptydu fuzyjnego do błony gospodarza. Kolejnym etapem jest zmiana położenia pęczka helis HRB, który przechodzi na drugą stronę cząsteczki i wkomponowuje w rowek struktury coiled-coil HRA. Razem formują one fuzyjną strukturę α-hairpin. Reorientacja odcinka HRB powoduje przestrzenne zbliżenie znajdującej się za nim domeny transmembranowej i peptydu fuzyjnego, dzięki czemu fuzja efektywnie przebiega.
Ryc.2. Schematyczna wizualizacja sekwencji domen (a) oraz cząsteczki w stanie przedfuzyjnym (b) i pofuzyjnym (c) białka paramyksowirusa (klasa I). Peptyd fuzyjny (FP) zaznaczony na zielono; domena transmembranowa (TM); część cytoplazmatyczna (CT); HRA i HRB to odpowiednio Heptad Repeat region A i B. [Russel et al., 2006]
Ryc.3. Schematyczna wizualizacja procesu fuzji białek klasy I na przykładzie hemaglutyniny wirusa grypy. [Sollner, 2004].
Jednym z możliwych bodźców inicjujących fuzję otoczki wirusa z błoną gospodarza jest obniżenie pH. Powoduje ono ekspozycję peptydu fuzyjnego i jego insercję (w formie spinki do włosów) do błony gospodarza. Zastanawiający mechanizm tej reakcji znajduje uzasadnienie po rozważeniu eksperymentów przeprowadzonych z użyciem białek należących zarówno do klasy I, jak i klasy II.. Aktywacja poprzez obniżenie stężenia jonów H+ następuje zawsze w okolicy pH 6. Jedynym aminokwasem, którego wartość pK, w zależności od lokalnego otoczenia, oscyluje w tym zakresie jest histydyna. Ponieważ znane są już przykłady, kiedy to strukturalne zmiany warunkowane są uprotonowaniem tego aminokwasu, można przypuszczać, że i tutaj histydyna właśnie odgrywa istotną rolę. Analiza sekwencji dowiodła, że tak wśród białek klasy I, jak i klasy II istnieje kilka konserwatywnych reszt histydynowych i sąsiadujących z nią w stanie przedfuzyjnym, naładowanych dodatnio aminokwasów. Modelowanie komputerowe ukazuje, że uprotonowanie histydyny, jakie ma miejsce przy obniżeniu pH środowiska, prowadzi do „wypchnięcia” jej z dotychczasowego otoczenia (rozdzielenie ładunków dodatnich w rejonie konserwatywnym) i takiej reorientacji całej cząsteczki białka, że powstają mostki solne w innym rejonie molekuły. Stabilizują one silnie nowa konformację, przez co przejście te okazuje się nieodwracalne. Jako poznany eksperymentalnie, fakt ten dodatkowo przemawia na korzyść hipotezy zaangażowania reszt histydynowych w odpowiedź na zmianę stężenia protonów.
Ryc.4. Schematyczna wizualizacja zmian konformacyjnych cząsteczki białek fuzyjnych przebiegających pod wpływem zmiany pH środowiska. [Kampmann et al., 2006].
Analizując mechanizm działania wirusowych białek fuzyjnych nietrudno ulec zdumieniu nad jego perfekcją i zmyślnością. Jego dogłębne poznanie ma oczywiście również wymiar pragmatyczny - daje możliwość opracowania nowych terapii antywirusowych, a ponieważ sam proces jest zakonserwowany u poszczególnych klas wirusów, także nadzieję na wygenerowanie skutecznych szczepionek. Pewne nadzieje pokłada się w opracowaniu inhibitorów oddziaływania białek z błoną komórek eukariotycznych Jednym z proponowanych mogłoby być monoklonalne przeciwciało rozpoznające epitop odpowiedzialny za niezbędną dla wiązania przez niektóre białka (w tym białko wirusa SFV) cholesterolu, składnika natywnej błony. Innym potencjalnym celem może być ulokowany w rdzeniu trimeru rejon oddziaływania monomerów ze sobą. Wykazano eksperymentalnie, choć mechanizm nie został jeszcze poznany, że obecność peptydów pochodzących z tego rdzenia może hamować oligomeryzację. Natomiast wobec wirusów podlegających w początkowym etapie endocytozie poprzez receptor skutecznym inhibitorem progresji infekcji w warunkach in vitro jest zastosowanie inhibitorów zakwaszania wnętrza endosomu, jak bafilomycyna lub chlorek amonu.
Literatura:
1. Thorsten Kampmann, Daniela S. Mueller, Alan E. Mark, Paul R. Young, Bostjan Kobe. The Role of Histidine Residues in Low-pH-Mediated Viral Membrane Fusion. Structure 14, 1481–1487, 2006.
2. Margaret Kielian. Class II virus membrane fusion proteins. Virology 344, 38 – 47, 2006.
3. Thomas H Sollner. Intracellular and viral membrane fusion: a uniting mechanism. Current Opinion in Cell Biology 16, 429–435, 2004.
4. Charles J. Russell and Laura E. Luque. The structural basis of paramyxovirus invasion. Trends in Microbiology 14, 243 – 246, 2006.
---
Barbara Lachowicz jest studentką biotechnologii medycznej na Uniwersytecie Wrocławskim (2003-2008). Członkini Studenckiego Koła Biotechnologów "Przybysz", działającego w obrębie macierzystej uczelni. Naukowe zainteresowania koncentrują się wokół biologii komórki - dotyczą głównie aspektu patologii/terapii nowotworów.